1.prednáška Genomika a Projekt ľudského genómu
1.pred.Genomika a Projekt ľudského genómu
Čo sa očakáva od molekulovej genetika
- jednoznačná oidentifikácia organizmov
- detekcia génov náchylnosti ku chorobám a genetickým defektom
- zvýšenie účinnosti selekcia v šlachtení rastlín a zvierat produkujúcich potravinové zdroje
- tvorba transgénnych jedincov
- génová terapia
Fakty
- nukleárna DNA je lokalizovaná vjadre buniek
- haploidný genóm obsahuje 3x109bp
- počet predpokladaných génov 20 000- 30 000
- kódujúce sekvencie 2- 3%
- genetický kód je univerzálny
- gény sú lokalizované na chromozómoch lineárne
- gény majú exon/intrónovú štruktúru
- diploidný genóm obsahuje 2n chromozómov ( 2n- 2autozómov a 2 pohlavné chromozómy- X a Y)
Jednotlivé úrovne analýzy toku informácie v bunke
JADRO
- DNA ( genóm)
- Pre- mRNA
- mRNA
CYTOPLAZMA
- mRNA ( transkriptóm)
- proteín ( proteóm)
- metabolity ( metabolóm)
Štruktúrna genomika 3 kroky
- genómové mapovanie
- genómové sekvenovanie
- anotácia genómu
Funkčná genomika metódy
Ďalej treba vedieť akú funkciu v organizme má, či je funkčný stále len len keď treba, alebo nefunkčný, a to umožňujú postupy molek. genetiky:
- DNA arraye a čípy
- Real- time PCR
- Northern hybridization
- Transkripčná fúzia
- 2D elektroforéza
- Hnotová spektrometria
- Proteínové sekvenovanie
- Traslačná fúzia
- Imunodetekcia
- Enzýmové aktivity
- Chromatografia
- Hmotová spektrometria
- NMR
= zadefinovať funkcie a odchýlky od ich fáz
Genóm- celkový genetický materiál jednotlivca
Transkriptón- sada transkripovaných sekvencií
Proteóm- sada proteínov kódovaná genómom
Štruktúrna genomika
Zákloadné úlohy:
- genómové mapovanie
- genómové sekvenovanie
-anotácia genómu
Projekt ľudského genómu
- navrhnutý v 80.rokoch, oficiáolny začiatok 1990
- navrhnutý postup:- genetická mapa, - fyzikálna mapa, - úplná sekvencia genómu človeka
- očakávaná doba trvania: 15 rokov
- očakávaná cena: 3 miliardy dolárov
Pomocné projekty
- vytvorenie nových technológií- zlepšenie techník umožňujúcich fyzikálne a genetické mapovanie, zlepšenie techník sekvenovania DNA, konštrukcia databáz
- sekvenovanie genómu piatich modelových organizmov- E.coli, Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophilla melanogaster, Mus musculus
- ELSI: etické, legálne, sociálne implikácie
- 1981: punlikovaná sekvencia DNA ľudskej mitochondrie ( 16 569 bp)
- 1988 vzniká HUGO- Human Genome Organization
Problémy mapovania ľudského genómu
- problémy konštrukcie genetickej mapy človeka
o človeka nemožno krížiť
o len málokedy môžeme študovať rodokmene s genetickou chorobou tak dobre, že sme schopní vytvoriť gentickú mapu človeka ( napr. drosophila s čiernym telom a zakrpatelými krídlami)
- do roku 1970 bola pozornosť zameraná na rozdiely v štruktúrnych génoch
o lenže asi iba 1,5% ľudskej DNA kóduje proteíny
o a na správnu stavbu týchto proteínov je silný selekčný tlak
- od 70. rokov sa začala skúmať negénová NDA, ktorá sa výrazne líši od jedného človeka k druhému, a bola vynájdená metóda skúmajuca RFLPs
-
Rozvoj nových techník a zdokonalenie metód mapovania DNA markérov
- využitie reštrikčných enzýmov
o RFLP
o PFGE
o Ribotyping
- značkovanie DNA
- PCR a jej modifikácia
- DNA seyuencing
- DNA microarrays
Genetická mapa
- metóda je založená na relatívnych vzdialenostiach markérov, ktoré odpovedajú frekvenciam rekombinácie ( pravdepodobvnosti crossing- overov)
- ako marker môže slúžiť buď gén a jeho fenotypový prejav, alebo akákoľvek iná identifikovateľná sekvencia, ako sú RFLPs alebo mikrosatelity
- mapovanie skončilo najdením cca 5 000 markérov v celom ľudskom genóme
Fyzikálna mapa
- snaží sa vyjadriť vzdialenosti medzi markérmi v absolútnej miere, najlepšie v počte nukleotidov
- pre genóm človeka bola dokončená cca 1994
- DNA celého chromozómu je zostrihaná dvoma reštriktázami na identifikovateľné fragmenty, ktoré sa prekrývajú
- je použitá próba ( fragment, získaný izoláciou, ktorý sa môže označiť), pomocou ktorej sú zisťované fragmentry, ktoré sa prekrývajú
- metóda sa nazýva prechádzanie chromozómu ( chromosome walking)
(Francis Collins a Craig Venter)
- vo februári 2001 celera publikuje v Science sekvenovanie 90% genómu človeka
- v tom istom týždni publikuje to isté verejné consortium v časopise Nature
- spory: verejne consortium vystavuje výsledky sekvenovania priebežne....
Roku 2001
- cca 50 organizmov je buď celkom alebo takmer sekvenovaných
o asi 10 archeí
o E. coli
o Saccharomyces cerevisiae
o C. elegans
o ArABIDOPSIS THALIANA
Štúdium a porovnávanie génov
- asi tretina génov u E. coli pre vedcov bola úplne nová
- genóm šimpanza je na 98,77% identický s humánnym genómom
- v priemere sa typický humánny proteín- kódujúci gén sa líši od ortológu šimpanza iba v dvoch aminokysleinových substitúciach
- väčšie diferencie sú iba na chromozóme 2 človeka, ktorý je ( predpokladá sa) produktom fúzie chromozómov 12 a 13
Počty génov
- mycoplasma genitalium- 480 génov ( asi len 265- 350 génov je naozaj potrebných k životu)
- mravec Myrmecia pilosula má iba 1 pár chromozómov / samec len jediný chromozóm)
- papraď 630 chrom.
- Najnižší počet chromozómov : ďatlík uhorový 2N= 40
- Najvyšší ledňačik riečny 2N= 132
- Väčšina vtákov má okolo 80 chromozómov
- Chromoz´=omy vtákov sú však veškostne diferenciované na makrochromoz´=omy a mikrochromozómy, mikrochromozómy tvoria len 18%- 23% genómu
Ľudský genóm
- 41% genómu tvoria GC páry, 59% sú AT
- približne polovicu genómu tvoria repetície
- gény tvoria cca štvrtinu genómu
- len asi 1,5% ale kóduje proteíny, rRNA a tRNA
- zvyšok sú intróny
- u baktérií 90% genómu kóduje proteíny, 10% sú regulačné oblasti
- Caenorhabditis erlegans- 27% genómu tvoria gény kódujúce proteíny
- Drosophila- 13%
- stovky génov človeka vykazujú bakteriálny pôvod a do ľudského genómu sa dostali zrejme niekedy v rôznych fázach evolúcie stavovcov horizontálnym transférom
- niekoľko desiatok génov pochádza z transpozibilných elementov
- aj keď je približne polovica genómu človeka tvorená transponzibilnými elementami, zdá sa, že v hominidnej línii tieto elementy postupne strácali aktivitu. V genóme človeka zdá sa že sú už všetky celkom neaktívne?!
- genóm jadra a mitochondriije tu rozsah v objeme, počte funkčných génov, z hľadiska biodiverzity
Ľudský genóm
- rekombinačné frekvencie sú až dvojnásobné v distálnych oblastiach chromozómov oproti priemeru a všeobecne sú častejšie v kratších ramienkach (približne jeden crossing- over na každom ramienku každého chromozómu v priebehu meiózy)
- bolo identifikovaných viac ako 1,4 miliónov SNPs. Tento nález má veľký význam pre porovnávanie genómov ľudí z rôznych oblastí sveta
Ľudský genóm
Jadrový genóm 3200 Mb
Mitochondriálny genóm 16,6Mb
Euchromatín 2900- 3000Mb
Konštitutívny heterochromatín 200MB
Kódujúca DNA 50Mb ( 1,5%)
Regulačné oblasti 100Mb 3%
Nekódujúca repetetívna
Prepisovanie génov u človeka
- 800 génov je house- keeping genes- tieto sa prepisujú v každej bunke ľudského tela
- každá bunka ľudského tela prepisuje celkom asi 100 000 génov
- najmenší autozóm človeka je 21
- chromozóm 21 obsahuje asi len 225 génov
- u 40% ľudských génov sa predpokladá alternatívny zostrih
- asi 25% genómu človeka tvoria oblasti, ktoré sú vúčšie než 500 000 bp a ktoré sú celkom bez génov a sú preto nazývané gene deserts- génové púšte
- gény ležia hlavne v oblastiach bohatých na GC
-